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                                                 常见问题

我该如何处理和保存多肽?

如何溶解多肽?

是否可以预测一个肽段是可溶的?

如何选择适合自己研究的多肽纯度?

什么是多肽的纯度?

什么是肽净含量?

为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

假二肽(Pseudoproline Dipeptides)可以帮助困难多肽的合成吗?

我们的多肽是如何纯化的?

什么是高效液相色谱(HPLC)?什么是反相高效液相色谱(RP-HPLC)?

为什么要进行N端乙酰化,C端酰胺化修饰?

影响多肽稳定性的因素有那些?

多肽PEG修饰

荧光标记时,肽和修饰标记的染料之间需要加一个间隔吗?

多肽与其他化合物或者载体接合考虑的因素有那些?

如何将多肽溶解在DMSO中?

点击多肽(Click Peptide)有那些修饰可以选择?

常见的抗体中抗原决定部位标签多肽(Antibodies to Epitope Tags)有那些?

 多肽滴定

 

1. 我该如何处理和保存多肽?

多肽一般长期保存需要避光保存,并应保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短时间以室温运输。多肽在-20℃很稳定,特别是冷冻干燥并保存在干燥器中,在将它们暴露于空气之前, 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。

对于含Cys, Met orTrP的多肽,脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽可易空气氧化,在封瓶前,慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含GlnAsn的多肽也容易降解,所有这些肽与不含这些有问题简单的那些肽相比,生命期有限。

多肽保存指南:1需要长期保存的多肽,应以冻干粉形式存放在含有干燥剂的密封容器内,置于-20°C保存,-80°C效果更好,可以最大限度地避免多肽降解。这种储存方式可以使多肽可保存数年,避免了被细菌降解和氧化,也可以避免二级结构的形成。

            2 尽量避免反复冻融

          3 尽量避免以溶液状态贮存(为使用方便可以将冻干粉分装后贮存)

          4 如果必须以溶液状态贮存,建议用无菌水在弱酸性条件下溶解多肽并于-20℃贮存.

打开包装: 在打开包装和称重前,请先将多肽在干燥器中平衡至室温。因多肽往往具有吸湿性,未经平衡到室温的多肽在打开盖子后易凝结,从而降低了多肽产品的稳定性。

称重: 迅速称取您所需的多肽,并将剩余多肽继续储存在-20°C或更低温度。与其他多肽相比,含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短

2. 如何溶解多肽?

多肽的溶解性很大程度上取决于多肽的极性。酸性的蛋白溶解于碱性溶液,而碱性蛋白可溶解于酸性溶液,含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中,如DMSODMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇,然后加水(蒸馏水)稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解,因为DMSO可能造成侧链氧化。

多肽溶解测试: 在多肽溶解之前先取小部分进行多肽溶解测试,您需要测试几种不同的溶剂,直到找到最适当的一种。超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。(注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。)

将每个酸性氨基酸赋值为-1,包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、以及羧基末端-COOH。每个碱性氨基酸赋值为+1,包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)以及氨基末端-NH2。然后计算整个多肽的电荷数。

如果整段肽所带电荷是阳性的,说明该肽是碱性的。可先尝试用蒸馏水来溶解;如果不溶于水,接着尝试用少量10%-25%醋酸溶解,如果仍然失败的话,添加一些TFA10-50微升)来增溶,然后用水稀释至理想浓度。

如果整段肽所带电荷是阴性的,说明该肽是酸性的。酸性的多肽可以尝试用PBSPH 7.4)来溶解,如果不溶的话,添加少量的碱性溶剂,如0.1 M的碳酸氢铵,然后加水稀释至理想浓度。含有游离半胱氨酸的多肽应溶于脱气的酸性缓冲液中,因为当PH值大于7时,巯基会被迅速氧化成二硫化物。

如果整段肽电荷是零,说明肽是中性的。中性肽通常溶于有机溶剂。首先,尝试添加少量乙腈、甲醇或异丙醇。对于高度疏水的多肽,可使用少量的二甲基亚砜溶解,然后用水稀释至理想浓度。对于含有自由半胱氨酸的肽,需使用DMF而不是DMSO。对于有聚集倾向的肽,可添加6M盐酸胍或8M尿素,然后进行必要的稀释。

为了防止或尽量减少多肽降解,请将多肽以冻干粉形式保存在-20°C-80°C更佳。如果需要保存溶液肽,最好分成小样存放,以避免反复冻融。一份样品融冻后未用完,应扔掉。细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦,所以请将肽溶于无菌水或肽溶液过滤除菌。

碱性氨基酸: K, R, H, N-terminus
酸性氨基酸: D, E, C-terminus
极性中性氨基酸: F, I, L, M, V, W, Y
非极性疏水氨基酸: G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙酰基,酰胺基

举例说明: 
RKDEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 认为是碱性多肽,见步骤
EKDEFILGASEHR: (+4) + (-5) = -1 认为是酸性多肽,见步骤
AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 认为是中性多肽,见步骤4

3.一个肽段是否可溶能预测吗?

(1) 多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,PheTrp,多肽很难溶解于水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成,都有可能有问题。

(2) 一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%,不能连续5个连续aa为疏水性,带电荷的氨基酸的(正电荷K,R,H,N-terminus,负电荷D,E,C- terminus)的比例达到20%,在多肽的NC短如果能增加极性氨基酸,也可以改善溶解性。

我们无法通过研究多肽的结构来预测其在水中的溶解度。然而,赖氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于预测溶解度,尤其是短肽。与此相反,含有天门冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的,但易溶于稀氨水或碱性缓冲液。

4. 如何选择适合自己研究的多肽纯度?

多数多肽都是在TFA体系下分离纯化的,所以多肽以TFA盐的形式最多,其次药物肽一般有醋酸盐及盐酸盐的形式,极少数药物肽会有一些特殊的盐形式。转盐方式多为离子交换法和HPLC法,而脱盐可用G25(安马西亚出的一种葡聚糖凝胶)柱。

粗品肽不推荐用于生物实验。粗肽可能含有大量的非肽类杂质,如残留的有机溶剂、清除剂、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除,通常交付的肽以TFA盐的形式存在。如果残留的TFA影响您的实验,我们推荐其他盐形式,如醋酸盐和盐酸盐等。这些盐通常比常规TFA盐贵20-30%以上。这是由于在转化过程中出现更多的肽损失和需要更多的原材料。

synpeptide建议对各种项目采用以下级别的肽纯度:

>70% 肽纯度

肽微阵列

作为制备抗体的抗原

层析法

酶联免疫吸附试验检测抗血清滴度

>80% 肽纯度

免疫印迹法(非定量)

酶底物肽(非定量)

封闭肽(非定量)

亲和纯化

磷酸化检测

蛋白电泳的应用和免疫细胞化学

>95% 肽纯度

标准酶联免疫吸附试验和RIA(定量)

受体配体相互作用(定量)

体内体外 生物学测定

酶的研究和阻断实验(定量)

NMR研究

质谱分析

其他定量检测

>98% 肽纯度

SAR研究

临床试验

APIs(药物活性成分)

工业品

X-ray晶体研究

其他敏感的实验:酶与底物、受体与配体相互作用、阻断和竞争实验

5. 什么是多肽的纯度?

多肽的纯度是指HPLC方法在214nm处检测到的目标多肽的含量(214nm是肽链的吸收波长),紫外分光光度计检测不到水和残留的盐不。可发现其他的杂质包括:缺失序列(缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列),截断序列(加帽过程中产生的序列)脱保护不完全序列(产生于整个合成过程或最后的裂解过程)。

多肽纯化不涉及水和盐。HPLC纯化会产生少量的TFA,如:游离的氨基末端和其他侧链如ArgLysHis都可生成少量TFA杂质。通常交付的多肽多含有微量TFA和残留水。即使处于冻干状态,水也会因共价结合的能力不同而不同程度地存在着。

在多肽中还存在哪些其他物质(杂质)?

杂质

纯化前的多肽

纯化后的多肽(HPLC)

缺失序列1

截断序列2

脱保护不完全序列3

裂解过程中被修改的序列4

DTT (dithiothreitol,二巯基苏糖醇)

TFA (trifluoroacetic acid,三氟乙酸)

Acetic acid(醋酸)

某个氨基酸发生了副反应的多肽,如脯氨酸异构化等。

纯化前的多肽中包含的杂质包括多肽和非多肽物质, 纯化后的多肽中包含的杂质除了TFA盐,大多数为序列被修改的多肽。

缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列

为避免缺失序列的产生而进行的加帽操作,截断序列即产生于加帽过程中

产生于整个合成过程或最后的裂解过程

保护基重新附着在多肽的其他位置

6. 什么是肽净含量?

肽净含量不同于多肽纯度,多肽纯度仅指多肽本身所含肽产品的含量及杂质的含量,不包括水份等杂质。而多肽含量则是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比。通常一条多肽产品中除了多肽本身还包括生产过程中带入的非盐组份,如水,被吸收的溶剂、配位离子和盐等。即使在严格的冻干状态下,也会吸收微量的水。因此一条多肽即使纯度达到99%,因为产品中还包含水份及有机盐分等,它的含量可能也只有70-80%因纯化批次和冻干工艺不同会导致肽净含量有所不同一般我们可以用N元素分析或氨基酸分子的方法来检测多肽的净含量。如果多肽序列中有TrpTyr可以采用紫外的方法分析肽含量,根据摩尔消光系数:

Tryptophan 5560 AU/mmole/ml

Tyrosine 1200 AU/mmole/ml

at 280 nm at neutral pH using a 1-cm cell

一条多肽的摩尔消光系数可以根据每个TrpTyr的系数进行加和,然后根据所测到的在280nm处的吸收值通过公式进行计算

mg peptide per ml = (A280 x DF x MW) / e

A280   280 nm实际吸收值(1-cm cell,

DF   是稀释因数, MW 多肽分子量

e     多肽的摩尔消光系数

 

 

7.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

多肽合成与引子合成有比较大的区别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,Thr这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下几种情形,合成效率和产物的纯度都比较低,如:重复Pro,Ser-Ser,重复Asp4个连续Gly等。

 

8. 假二肽(Pseudoproline Dipeptides)可以帮助困难多肽的合成吗?

是的,Pseudoproline Dipeptides可以在多肽缩合中,减少多肽的Alpha转角以及Beta折叠空间结构的产生,使得多肽保持线性,有利于多肽的合成,提高多肽的粗品纯度。Pseudoproline的结构在多肽用TFA切割时同时会去掉,得到正常的多肽。Pseudoproline Dipeptides主要有Fmoc-AA-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OHFmoc-AA-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH二大系列,AA代表氨基酸。如果有侧连的,侧连带保护。

Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH    Fmoc-Asp(OtBu)-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH

9. 我们的多肽是如何纯化的?

多肽纯化一般使用反相柱(C8C18)214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂,pH2.0Buffer A为含0.1%TFA in ddH2OBuffer B1%TFA/ACN/pH2.0。纯化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解后,然后用Buffer A稀释;对疏水性强的多肽,有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗产物,如果多肽不长(15aa以下),一般会有主峰,主峰通常为全长产物;对于20aa以上的长肽,如果没有主峰,HPLC需搭配Mass来判定分子量,进而确定哪个峰是所要合成的多肽。

 

10. 什么是高效液相色谱(HPLC)?什么是反相高效液相色谱(RP-HPLC)?

   多肽的HPLC 模式主要有三种: 一是凝胶过滤色谱, 按照肽分子的大小进行分离, 二是离子交换色谱, 按肽分子所具有的带电基团的性质和数目进行分离; 三是反相色谱, 按照肽分子的疏水性强弱进行分离。

   HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

反相高效液相色谱(RP-HPLC):结果与保留值之间的关系:利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在220氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在1060氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间,而含525个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。

11. 为什么要进行N端乙酰化,C端酰胺化修饰?

多肽是用来模拟蛋白的,为了模仿蛋白的表现,我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后,两端的电荷数将与基因体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。 总体而言: 如果是出自蛋白C端的序列,通过乙酰化将N端屏蔽; 如果是出自蛋白N端的序列,通过酰胺化将C端屏蔽; 如果是出自蛋白中间部分,用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。这些修饰可以使肽不会被降解掉,也可以使肽模拟它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始状态。

12. 影响多肽稳定性的因素有那些?

影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β-消除、聚集等,研究显示合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中,天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下);甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化,对光照也较为敏感;天冬氨酸参与形成的肽链较易断裂,尤其是Asp-ProAsp-Gly肽键。由于一个多肽分子中通常会含有多种不稳定性的氨基酸残基或肽键,因此合成多肽可能的降解机制和降解产物较为复杂。而多肽的聚集主要是由于疏水作用引发的,尽管目前还很难准确预测哪些多肽易发生聚集,但至少对于一些中长肽而言需对可能存在聚合物进行研究。

13.多肽PEG修饰

PEG修饰剂又称聚乙二醇修饰剂,修饰性PEGPEG修饰剂等。是带有官能团的聚乙二醇,目前主要用于蛋白质药物修饰,以增加体内半衰期,降低免疫原性,同时还可以增加药物的水溶性。近几年来修饰性PEG在制药研发中应用广泛,在药物药效缓释中起到重要作用。

PEG修饰剂常见的修饰基团大致可总结如下:

氨基(-Amine-NH2,氨甲基-CH2-NH2,马来酰亚胺-Mal,羧基-COOH,巯基(-Thiol-SH,琥珀酰亚胺碳酸酯-SC,琥珀酰亚胺乙酸酯-SCM,琥珀酰亚胺丙酸酯-SPA,琥珀酰亚胺-NHS,丙酸基-CH2CH2COOH,醛基-CHO,丙烯酸基-Acrylate,丙烯酸基-AC,叠氮基-Azide,生物素基-Biotin,荧光素基-Fluorescein,戊二酸基-GA,酰肼基-Hydrazide,炔基-Alkyne等。

PEG修饰剂常见分类:

1)直链PEG修饰剂:mPEG

2)双官能团修饰剂:HCOO-PEG-COOHNH2-PEG-NH2OH-PEG-COOHOH-PEG-NH2HCL·NH2-PEG-COOHMALPEGNHS,  

3)根据分子量的大小又有2000300050001000020000

所以在进行PEG化修饰时需要确定PEG的种类,官能团要求以及分子量大小范围。

 

14. 荧光标记时,肽和修饰标记的染料之间需要加一个间隔吗?

多数染料属于大分子量芳香族氨基酸,在多肽中引入这一类大型分子,为了避免多肽与标签之间发生相互作用,维持蛋白的构象及其生物学活性,我们推荐引入一个可弯曲的间隔区,比如Ahx, Ahx是一个含有6碳分子的环状结构,可以维持荧光标签的稳定性。否则,FITC很容易结合多肽序列中的半胱氨酸残基或者赖氨酸残基。

通常情况下,生物素、FITC一类的染料既可以标记在蛋白的氨基端也可以标记在蛋白的羧基端。然而,为了在最短时间内,最便捷又高效地合成多肽,我们推荐客户选择标记在氨基端。因为一个多肽的合成往往是从羧基端开始的,这样一来,氨基端的修饰便成为最后一个环节,不需要再进行特别的结合作用。反之,羧基端修饰需要额外的环节,因此过程更加复杂。

15. 多肽与其他化合物或者载体接合考虑的因素有那些?

经常有一些多肽需要与一些药物或者特定功能的化合物进行连接,或者要把多肽连接到某些载体上去,需要化学键进行结合,一般多肽具有氨基或羧酸官能团可以考虑下相应的羧酸或氨基进行缩合,另外一种选择是通过巯基(thiol)与马来酰亚胺(Maleimide)在PH 8的环境下连接。多肽中可以同过带有Cys或者Maleimide官能团进行修饰。Maleimide修饰通常可以选择化合物3-Maleimidopropionic Acid (CAS 7423-55-4)实现。

16. 如何将多肽溶解在DMSO中?

二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物,分子式为(CH3)2SO,常温下为无色无臭的透明液体。DMSO作为冷冻保护剂经常应用于细胞库。在细胞冷冻过程中,DMSO可防止胞内/胞外晶体的形成,其工作浓度为10%DMSO通常可与盐或血清白蛋白结合。

疏水性多肽可以很容易地溶解在DMSO中。但DMSO可增加细胞的通透性,若多肽溶解于DMSO中则会对细胞产生毒性作用。高浓度的DMSO绝不可应用于细胞培养中。浓度为5%DMSO即可让细胞膜溶解。大多数细胞株可以容忍0.5% DMSO,少许可以容忍1%的浓度,而不表现出严重的细胞毒性。然而原代细胞培养对其更敏感。所以如果是用原代细胞做剂量/反应曲线(可行性),其浓度应低于0.1%

对于某些疏水性非常高的多肽,可先尝试将其溶解在少量的DMSO(30-50ul,100%)中,然后慢慢 (一滴一滴地)将其添加到不断搅拌的水溶液如PBS或其他想要的缓冲液中,直至理想浓度。如果滴加过程中,肽溶液开始变浑浊,说明已经达到了溶解极限。另外,超声波有助于多肽溶解。

17.点击多肽(Click Peptide)有那些修饰可以选择?

点击化学的代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应(Copper-Catalyzed AzideAlkyne Cycloaddition)。点击化学的概念对化学合成领域有很大的贡献,在药物开发和生物医用材料等的诸多领域中,它已经成为目前最为有用和吸引人的合成理念之一。具体在多肽中应用主要是在多肽中带有叠氮基或炔基官能团,常用的化合物有以下几种可以选择。

Fmoc - 4 azidophenylalanine    Fmoc - Phe(N3) - OH;

Fmoc Azidohomoalanine

Fmoc - D propargylglycine   Fmoc - D - Pra - OH

Fmoc - L - propargylglycine    Fmoc - L - Pra - OH

Fmoc - Lys(N3) OH Fmoc - azidolysine; Fmoc - lys(azide);

Azidoacetic acid

6-Azidohexanoic acid

Propiolic acid

18.常见的抗体中抗原决定部位标签多肽(Antibodies to Epitope Tags)有那些?

 

Tag Sequence

HIS HHHHHH

c-MYC EQKLISEEDL

HA YPYDVPDYA

VSV-G YTDIEMNRLGK

HSV QPELAPEDPED

V5 GKPIPNPLLGLDST

FLAG DYKDDDDK

 

19. 多肽滴定

小肽的滴定曲线与侧链含有可解离基团的氨基酸的滴定曲线差不多,但随着肽链的增长,侧链可解离基团的增多,其滴定曲线将变得很复杂。多肽在水溶液中以何种解离形式存在,与溶液的pH值密切相关,如已知多肽各解离基团的pK’值,就很容易知道在某一pH条件下,多肽各解离基团的存在形式。当多肽以净电荷为零的离子形式为主要存在形式时,这时溶液的pH值就是该肽的等电点pI

 

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