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聚乙二醇修饰技术

作者:admin     时间:2017/3/14 15:26:55


                                                                        多肽和蛋白质中氨基的聚乙二醇化修饰方法


   在多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法中 ,主要是对 N 末端或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰。因为蛋白结构中通常存在多个氨基 ,所以控制和确定修饰位点及修饰程度一直是蛋白质的聚乙二醇化修饰中的一个难点。肽类化合物的合成中可以通过采用适当的保护策略来实现对氨基的定点修饰。

1. 1 N端氨基的酰化修饰

为了实现对肽链中氨基的聚乙二醇化酰化修饰,需要在聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基。1993年,报道了在固相多肽合成中应用单甲氧基聚乙二醇的羧基衍生物对肽链的N端氨基进行酰化修饰的方法:以mPEG作原料,先合成mPEG—OCH2COOH和mPEG—OCH2CO —Nle —OH,在 mPEG中引入一个正亮氨酸(Nle)作为标记是为了便于确定每一个多肽分子上偶联了几个mPEG分子。应用 Fmoc 固相多肽合成法,先在树脂上合成全保护肽链,当游离出N 末端氨基后,以BOP作缩合剂,将mPEG—OCH2CO—Nle—OH作为一个单体偶联到肽链上,然后经三氟乙酸裂解和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到了平均分子量分别为2000和5000的mPEG修饰 N2端的4肽、8肽和12肽,mPEG修饰产物在RP-HPLC分析图谱上呈单一峰 ,结构经MALDT-TOF-MS分析得到确证。研究还表明,聚乙二醇对三氟乙酸处理稳定,但氟化氢处理时会有部分断裂,故此法不适用于Boc固相多肽合成法(eq. 1) .


若通过mPEG—NH2与琥珀酸酐反应引入羧基得到mPEG—NHCO2 CH2CH2COOH ,此类分子具有较好的稳定性,适用于固相多肽合成中。mPEG—NH2可通过购买商品化试剂获得,也可以由 mPEG—OH作原料合成。在mPEG—OCH2COOH 的合成中应用了丁基锂,反应需在绝对无水条件 下进行,而mPEG—NHCOCH2CH2COOH的合成比较容易些(Scheme 1) .



科学家以平均分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇甲酰琥珀酰亚胺(SC-mPEG)在弱碱性水溶液中(pH =8)修饰鲑降钙素(sCT),经 RP-HPLC分离得到N端、Lys 11和 Lys 18侧链氨基分别被聚乙二醇酰化修饰的三种产物 ,产物结构经酶解和质谱分析得到确证 ,它们在大鼠肾脏匀浆中的半衰期分别为12515,15713和28115 min ,比sCT在大鼠肾脏匀浆中的半衰期(418 min)显著增加.用相同的方法,以平均分子量为400的SC-mPEG对表皮生长因子(EGF) 进行修饰,经RP-HPLC分离到N端、Lys 28和 Lys48侧链氨基分别被聚乙二醇酰化修饰的三种产物。生物活性测定表明,N端修饰产物活性高于Lys 28和Lys48侧链修饰产物。SC-mPEG及其类似物在蛋白质的聚乙二醇化修饰中应用较多,反应条件容易实现,一般在弱碱性的水溶液中进行。控制蛋白质和SC-mPEG的比例可以得到单聚乙二醇化修饰的产物,产物的纯化方法也比较简便,可用透析、电泳及凝胶色谱等常用方法实现。由于SC-mPEG对游离氨基没有选择性,当有多个氨基时,往往难以实现定点的聚乙二醇化修饰,分析和确定产物中聚乙二醇的修饰位点也较难(Eq. 2)

1. 2 赖氨酸侧链氨基的酰化修饰

   以mPEG羧基衍生物修饰赖氨酸侧链氨基得到Fmoc-Lys(mPEG—OCH2CO) —OH ,在固相多肽合成中将其作为一个单体偶联到肽链中去,实现聚乙二醇对肽链中特定赖氨酸侧链氨基的聚乙二醇化修饰。也可以在固相合成过中用烯丙氧羰基(Alloc)保护特定位置的赖氨酸侧链氨基,肽链组装完毕后先脱除Alloc ,再将mPEG—OCH2COOH偶联到赖氨酸侧链氨基上去。然后经三氟乙酸裂解、RP-HPLC纯化可得到对肽链中特定赖氨酸侧链氨基进行聚乙二醇化修饰的产物。此法适用于Fmoc固相多肽合成法中对赖氨酸的定点聚乙二醇化修饰(Scheme 2)

1. 3 N端氨基的烷基化修饰

   研究者用聚乙二醇的醛基衍生物(mPEG—CHO)修饰rhG-CSF。反应在pH为5.0 的水溶液中进行,活泼的醛基可将聚乙二醇偶联到蛋白质分子的氨基上,同时以氰基硼氢化钠作为还原剂实现稳定的烷基化修饰。此法具有较好的选择性,主要是修饰蛋白质的 N末端氨基。其温和的反应条件适用于固相或液相多肽合成,此法应用于多肽的N端氨基修饰也会取得较好的效果(Eq. 3) .


2 多肽链中羧基的聚乙二醇化修饰方法

研究者以mPEG—NH2作原料修饰天冬氨酸侧链羧基得到Fmoc-Asp(mPEG—NH)—OH ,将其用到固相多肽合成中实现聚乙二醇对肽链中天冬氨酸侧链羧基的修饰。也可以在合成过程中用烯丙基(Allyl)保护特定位置的天冬氨酸侧链羧基,肽链组装完毕后在固相上先脱除 Allyl ,再将 mPEG— NH2偶联到天冬氨酸侧链羧基上,实现对肽链中特定天冬氨酸侧链羧基的聚乙二醇修饰。此法适用于Fmoc固相多肽合成法中对天冬氨酸或谷氨酸的定点聚乙二醇化修饰(Scheme 3)。在固相多肽合成中,若先将Fmoc—NH —PEG—COOH偶联到树脂上 ,再合成肽链,最后用三氟乙酸裂解,可以实现肽链C末端羧基的聚乙二醇化修饰。

3 多肽和蛋白质中巯基的聚乙二醇化修饰方法

在生长激素释放因子(GRF)类似物的C端引入半胱氨酸,在mPEG上引入巯基吡啶 ,然后通过二硫键交换实现mPEG对GRF类似物C端的修饰(Eq. 4)。


用定点突变法在蛋白质中引入半胱氨酸,以mPEG-MAL作为聚乙二醇化试剂 ,通过蛋白质上的巯基加成到mPEG-MAL的双键上实现对蛋白质的定点修饰,此法已在许多蛋白质的聚乙二醇化修饰中取得了良好的效果。mPEG-MAL可通过商品化试剂买到,也可以用 mPEG—NH2 为原料合成。若在肽链中引入半胱氨酸。也可以实现此类反应(Scheme 4)。



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