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环肽的合成技术

作者:admin     时间:2017/3/14 15:27:49


一、经典环肽:

1、二硫健型环肽

   与液相二硫键环肽合成一样,在固相组装肽链时选择半胱氨酸的侧链保护基至关重要。对此应该注意以下几点:

(1)桥连的两个位点半胱氨酸的侧链保护基必须相同,以确保同步脱除,同时氧化成二硫键;

   (2)含两对以卜二硫键时,除了各对桥头半胱氨酸的保护基要相同外,不互相连键的半胱氨酸的侧链保护基应该不同,而且它们的脱除条件应以互不千扰的正交方式为宜;

   (3)全部半胱氨酸的侧链保护基脱除条件不应使Linker发生裂解反应。

由于固相合成的特点,除了对Cys的侧链保护基有一定要求外,对氧化剂也应注意,使用在有机溶剂中易溶的,如I2 ,DMSO等条件。在液相反应中常用的氧化剂铁氰化钾[K3FeCN)6 ]、谷胱甘肽体系GSH/GSSG等,因在有机溶剂中难溶,不能用于固相氧化生成二硫键反应。在同一肽链上形成两对以上二硫键,而且确保正确配对,是比较困难的合成。现举例说明用固相方式是如何完成这种合成的(图)

固相生成3对二硫键的反应路线


2、内酰胺型环肽

与二硫键环肽合成相比,酞胺键环肽合成中氨基及羧基的侧链保护基比Cys的情况简单得多。再一个特点是桥连的位置以肽链的N端残基与C端残基相连即头接尾方式为多。在液相头接尾环肽合成中,与常规的缩合接肽反应一样,需要羧基活化条件即缩合剂的参与。由于固相肽合成中C端残基键连在载体Linker上,环合时无法用混合剂活化。在此情况下,酯键型Linker:受到N端-NH2的氨解作用应是固相方式头接尾制备酰胺型环肽的基本方式。虽然理论上所有的酯键型Linker都可发生分子内氨解反应。但除了生成六元环DKP形式的环二肽以外.只有肟型Linker树脂很容易与肽链N端氨基反应生成环肽:


很显然,其他酯键Linker的活性不足以发生六元环以外的分子内氨解。如果肽链上另有可游离的-COOH基(在合成中特意设计)。则可以在缩合剂的作用下发生酰胺键型环合。对此,在设计合成时必须充分利用目标肚中的Glu,、Asp等残基的结构特点,即设法使它们的侧链活性基与载体的Linker键合。剩下的α-氨基及α-羧基可以双向延长接肽,也可以单向延长接肽。当目标序列组装完成后N端与C端即可在缩合剂的活化下键合成环(图)。



侧链-C00H与载体连接的环肽合成

除了Fmoc化学方式外,也可以用Boc化学方式,但是成环位点的ASp或Glu依然需要正交式保护策略。例如,将Boc一AsP一OFm或Boc一Glu一OFm的侧链游离羧基与载体相连,先脱除Boc后在氨基一侧延伸肽键,最后脱除OFm,再使游离一COOH活化,发生分子内酰胺键环合。此种方式可以使Asp或Glu残基位于肽链中段。即不与载体相连,得到的是“头接中”形式的酰胺键环肽(图)。

部分肽链环化的固相合成


再有一种合成“中接中”环化肽的方法,是在肽链中引入一Lys一(Fmoc)一及一Asp(OFm)一或一Glu(OFm)一作为两个桥头残基:


   另外还有一种方法,以亚氨基二乙酸(Ida)为提供桥头一COOH基的构件,与N端-NH3基形成“头接中”形式的酰胺键环肽。此合成的特点是没有任何正交方式保护的氨基酸,无须附加的脱除Fmoc或OFm操作。


二、非经典环肽:

1、环酯肽

一般来说适用于酰胺键的合成方法均可进行分子内酯键的形成。与前面介绍的酰胺型环肽一样,选择桥头残基及其侧链保护方式是关键。作为酰键的前体之一,羧基组分一Asp(OtBu)一、-Glu(OtBu)一、一Asp(OFm)一及一(OFm)一为构件,前两种适于Fmoc保护策略,两种用于Boc保护策略。酯的另一前体羟基组分可以使用非氨基酸构件,如羟基酸或带酚羟基的羧酸,但它们仅适于定位在N末端:


更常用的羟基组分是利用3种天然氨基酸Ser, Thr及Tyr中的任何一种。但是它们的侧链保护基应该与N末端的α-氨基保护基互为正交方式脱除,才能避免α-氨基对酯化环合的干扰。此外它们可以放在肤链中的任何位置:

应该注意的是这种环酯合成的实用范围比较有限,因为除了桥头的位置外其他位置不应含有Lys、Ser、Thr、Tyr及Asp。这是由于它们的侧链保护基没有其他足够的正交保护及脱除方式(而Cys就有许多正交式保护基),对桥头残基的搭桥合环形成干扰,所以目标肽的结构设计会受到较多限制。

2、单硫醚环肽

研究发现,单硫醚型环肽在体内代谢比二硫键环肽慢,而且多具有非免疫原性。此类环肽的固相合成方法有以下几种。

(1) PCORR法(peptide cyclization on oxime resin)  此方式利用肟的Linker亲核试剂的进攻非常敏感的性质,将肽链引人Cys,脱除保护后游离的一SH基进攻Linker键,形成单硫醚环肤,同时发生Linker裂解,除去载体。在此情况下,N端的α-氨基应处于保护状态,否则肪Linker同样会发生胺解反应。为此,脱除Cys侧链保护基的条件与脱除a-氨基的条件应为正交方式:


   (2) Michael加成法  在肽链中适当位点的Ser残基上进行消除反应,生成脱氢丙氨酸(Dha),后者与肽链上的游离一SH基发生Michael加成得到单硫醚环肽,最后再脱除侧链保护及切除载体。此种方式又被认为是模拟生物合成的一种途径。


   另外一种经历Michael加成制备单硫醚环肽的方法是在肽链N端引人丙烯酰,然后进行Michael加成,得到“头接中”或“头接尾”型的环肽:

 

   (3)亲核取代法  肽链中的Ser除了经脱水生成Dha进行Michael加成外,还可

以使其侧链一OH转换为一Br ,然后与肽链上的一SH基侧链发生分子内亲核取代反

应,同样得到以Ala及Cys为两个桥点残基的单硫醚环肽:


如果预期产物为“头接中”或“头接尾”型的单硫醚环肽,可以在N端引人溴乙酰结构,随后进行分子内亲核取代。此方法更为简便,无须有关残基的结构转换:


3.氧、氮桥连型环肽

   N端引人卤代乙酞可以与肽链的Tyr、Lys、Arg、His等残基的侧链基团发生分子内亲

核取代。例如,与Tyr的酚羟基反应则生成一O一型环肽,与Lys的侧链氨基反应则生成一NH一型环肽。应注意的是同链上不得含有两个以上具活性侧链基的位点。


4.Mannich碱型环肽

  肽链上如果含有Tyr残基,其酚羟基的α位可以作为活泼氢的供体与胺及醛发生Mannich缩合。实际上肽链N端氨基即是现成的胺组分。环合时只需外加的醛构件即可制得Mannich碱型环肽。


5.模板介入型环肽

    研究发现。固相载体上键连的内消旋环氧化合物(2)在三甲基叠氮硅烷(TM-SN3)及铬-N3络合物(1)作用下可发生不对称催化开环,生成立体选择性产物反式叠氮环戊醇(3):

以手性模板3为支架,随后进行RGD}肽段合成。当天冬氨酸与3的羟基成酯相连时有两种缩合方式:①用常规的缩合剂DIC,得到构型不变的5,即仍为反式双取代,②用Mitsunobu反应条件形成的天冬氨酸酯与叠氮基互为顺式6。


以5及6为起始物,经过肽链组装后,分别使叠氮基转化为羧基前体结构8及11,,最

后与Arg的α-氨基缩合成环肽:


6,芳环平面介入型环肽

一般桥连结构的环肽已经改善了直链肽的构象柔曲性。研究发现,如果在桥连结构中介人芳香环结构,由于后者的平面性要求,使该类环肽的构象限定性进一步加强,因此可更好地改善其与受体结合的选择性,提高生物活性。此类环的合成需要一种含双活性功能基取代的芳环衍生物作为桥连构件,每个功能基与肽链上的桥头残基分别键连。下面的几个合成例中分别使用了氟代苯羧酸、碘代苄胺、氨甲基苯甲酸及三聚氰酰氯等作为桥连的前体。






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